生物醫(yī)學(xué)親和層析應(yīng)用分析

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1概述

親和層析屬于液相色譜，它是以共價偶聯(lián)了親和配體的介質(zhì)為固定相來吸附或研究與其發(fā)生相互作用的分子。親和配體可以是蛋白分子、酶、抗體、抗原，也可以是一段DNA或RNA序列、仿生染料、酶的底物或抑制劑、小分子化合物(如藥物或激素)等。很多親和配體具有很高的選擇性，將偶聯(lián)了配體的介質(zhì)裝在柱子中，可以很好的用于分離、檢測或研究復(fù)雜樣品中的目標(biāo)分子。親和層析介質(zhì)主要由三部分組成：配體、間隔壁、基質(zhì)。配體是決定親和層析成功與否的一個重要因素。根據(jù)配體的類型，可以將親和層析進(jìn)行分類，如凝集素親和層析、硼酸鹽親和層析、免疫親和層析、金屬螯合親和層析等。在設(shè)計(jì)和使用親和層析柱時，偶聯(lián)配體所使用的基質(zhì)的類型也很重要。以瓊脂糖或纖維素等多糖類物質(zhì)為基質(zhì)的親和層析介質(zhì)常用于樣品預(yù)處理或者靶分子的分離純化。這種基質(zhì)易于修飾和活化，有利于基質(zhì)和配體的偶聯(lián)，并且具有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性，非特異性吸附少。但是這種基質(zhì)的機(jī)械性能較差，在使用時柱壓不能太高，分辨率和效率相對于高壓系統(tǒng)也較低。對于高壓液相親和層析，可以使用二氧化硅顆粒或者整體柱材料為基質(zhì)[1]。采用這種基質(zhì)的親和層析柱可以用于HPLC或與其他分析方法(如質(zhì)譜)聯(lián)合運(yùn)用。

2親和層析應(yīng)用的常見方式

首先，要選擇合適的樣品處理緩沖液以利于目標(biāo)分子與配體的結(jié)合。將處理好的樣品上到親和層析柱上，與配體無相互作用或作用弱的分子從柱子上穿出；然后通過更改流動相的pH或添加競爭劑，使目標(biāo)分子與配體解離從而被洗脫下來。根據(jù)目標(biāo)分子的性質(zhì)，可以通過紫外吸收、熒光、質(zhì)譜等方法對其進(jìn)行檢測。親和層析的分離過程簡單、快速，具有較高的選擇性，廣泛用于生物醫(yī)學(xué)和藥物分析中樣品的分離和預(yù)處理。另外，除了可以利用親和層析的吸附作用來富集目標(biāo)分子外，同樣也可以利用親和層析來去除樣品中影響分析的分子。如在蛋白組學(xué)的研究中，可以用親和層析柱先去除白蛋白、IgG等高豐度蛋白，再研究低豐度蛋白[2]。

3凝集素親和層析

凝集素是一種非免疫來源的蛋白質(zhì)，能識別并結(jié)合特定類型的糖基，廣泛分布于植物、動物和微生物中[3]。凝集素親和層析以偶聯(lián)了凝集素的基質(zhì)為固定相，常用的凝集素有伴刀豆凝集素A(ConA)、麥胚凝集素(WGA)、榴蓮凝素等，它們能識別不同的糖基，廣泛用于分離和鑒定糖蛋白、糖肽、糖脂、寡糖[4]。

4硼酸鹽親和層析

硼酸鹽親和層析以硼酸鹽為配體。在堿性條件下，大多數(shù)硼酸鹽衍生物能與含順式二醇基團(tuán)的糖或糖蛋白結(jié)合。在過去的幾十年中，臨床實(shí)驗(yàn)室一直將其用于糖化血紅蛋白的定量。糖化白蛋白以及一些載脂蛋白也可以用類似的方法來分析研究[5]。T.Suksrichavalita等利用“點(diǎn)擊化學(xué)”(clickchemistry)的方法合成了新的硼酸鹽，可以用于分離糖蛋白如卵清蛋白和RNaseB[6]。將硼酸鹽和凝集素共同偶聯(lián)到基質(zhì)上，可以更好的用于分離糖蛋白[7]。

5免疫親和層析

免疫親和層析是利用生物體內(nèi)存在的抗原、抗體之間高度特異性的親和力進(jìn)行分離的方法。以抗體為配體，免疫親和層析可以用于分離純化激素、酶、多肽、病毒等[8]。在臨床實(shí)驗(yàn)室，該方法已經(jīng)被用于分析乙酰膽堿酯酶、聯(lián)苯胺、IgG、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等[9]。以抗原或蛋白A/G為配體，可以對抗體進(jìn)行純化。

6金屬螯合親和層析

金屬螯合親和層析是利用蛋白質(zhì)表面暴露的一些氨基酸殘基和基質(zhì)上的金屬離子之間的相互作用而進(jìn)行的親和純化。金屬離子通過螯合劑固定在基質(zhì)上，常用的離子有Ni2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等，它們與氨基酸殘基的結(jié)合能力有強(qiáng)有弱。金屬螯合親和層析可以用于藥物檢測前的樣品預(yù)處理，還可以結(jié)合質(zhì)譜用于疾病診斷標(biāo)志物的檢測[10]。

7生物分子相互作用研究

親和層析除了可以用于分離和測定靶分子，還可以用于研究生物分子的相互作用，如酶/抑制劑、蛋白/蛋白、蛋白/DNA等[11]。GSTpulldown就是一種研究蛋白相互作用的技術(shù)，其基本流程是：將“誘餌”蛋白與GST融合表達(dá)，當(dāng)融合蛋白通過偶聯(lián)了GSH的柱子時，可以通過GSH和GST的親和作用而吸附在柱子上，把待測樣品上到柱子上，與誘餌蛋白相互作用的蛋白就會被吸附到柱子上，再對其分析鑒定即可[12]。在生物醫(yī)學(xué)和藥物分析研究中，親和層析已經(jīng)成為一項(xiàng)常規(guī)的分離工具。通過使用不同的配體和基質(zhì)，并結(jié)合其他技術(shù)和方法，來達(dá)到所需的應(yīng)用目的。另外，親和層析還可以用于研究生物分子的相互作用等，相信未來親和層析的應(yīng)用會越來越廣泛。