環境影響論文:米諾環素微環境對人體的影響

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作者：張達屠冠軍韓亞新叢琳梁德勇單位：中國醫科大學附屬第一醫院

動物模型制作與分組：以腹腔內注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉，將大鼠俯臥位固定于實驗臺上。選定T10、T11為正中切口，常規消毒、鋪巾，沿皮膚、皮下逐層暴露，顯露出T10~T11棘突及椎板并咬除之，暴露硬脊膜。根據Nystrom法用10g力量動脈夾從兩邊夾住暴露脊髓，造成重復性好的固定壓迫，壓迫時間為5min，用4鄄0號絲線縫合傷口。損傷后每天人工排尿（便）2次，每2d局部消毒1次。模型動物隨機分成4組，每組12只。損傷組：運用Nystrom法造成T10~T11節段脊髓損傷；米諾環素組：同法造T10~T11節段脊髓損傷，受傷1h后用50mg/kg的米諾環素經口灌胃，24h后再次給50mg/kg的米諾環素經口灌胃，然后再予5d的25mg/kg的米諾環素經口灌胃；干細胞移植組：同法造T10~T11節段脊髓損傷，傷后第3天重新打開切口，用10滋L微量注射器在脊髓損傷區遠端1.5mm處注射10滋L細胞懸液（細胞密度1伊106/mL），避開脊髓中央血管，注射過程不少于2min，留置針頭3min以免細胞外泄；聯合治療組：同法造T10~T11節段脊髓損傷，受傷1h后用50mg/kg的米諾環素經口灌胃，24h后再次給50mg/kg的米諾環素經口灌胃，然后再予5d的25mg/kg的米諾環素經口灌胃；同時在傷后第3天重新打開切口，用10滋L微量注射器在脊髓損傷區遠端1.5mm處注射10滋L細胞懸液（細胞密度1伊106/mL），避開脊髓中央血管，注射過程不少于2min，留置針頭3min以免細胞外泄。

動物標本取材及處理：術后2周，以致死劑量水合氯醛處死大鼠，分別以無菌生理鹽水和4%多聚甲醛行左心室灌注。按原手術入路取出已損傷部位為中心遠近端各1.5cm長度脊髓。標本在4%多聚甲醛中固定3h，再于新配20%蔗糖溶液浸泡過夜。次日標本沉入蔗糖溶液底部取出，將表面蔗糖溶液吸干。用OCT膠包埋速凍，以損傷中心為目標于冰凍切片機切片，厚度為8滋m，鋪于經防脫片處理的載玻片上。進行熒光顯微鏡細胞計數。

MTT法描繪細胞生長曲線：取4個96孔板，每板分成6組，分別加入準備好的細胞（1伊105/孔），在5%CO2和37益的培養箱中孵育24h后吸出培養液，按照縱行分組在各孔中注入濃度為1、3、6、10、20滋g/mL的米諾環素培養基溶液及空白對照的全培養基各100滋L。在5%CO2和37益的培養箱中孵育24h后，避光條件下各孔中加入10滋LMTT，繼續孵育4h后吸出孔內混合液體，加入DMSO溶解，震蕩10min。選擇570nm波長，自動酶標光度計測定各孔光吸收值，記錄結果。以藥物濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

統計學分析數據以依表示，采用SPSS16.0統計軟件進行分析，2組間均數比較采用檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。<0.05為差異有統計學意義。

熒光顯微鏡觀察脊髓內移植的骨髓間充質干細胞的情況，結果顯示米諾環素前期治療可有效促進細胞的存活和遷移，干細胞移植組和聯合治療組骨髓間充質干細胞數量分別為7.08依2.71和11.9依2.15，與干細胞移植組相比，聯合治療組損傷中心可發現數量更多的骨髓間充質干細胞（<0.05）。損傷組與米諾環素組由于未進行細胞移植，故未發現骨髓間充質干細胞。通過MTT法描繪細胞的生長曲線（圖2），反映細胞的生長情況。空白對照組和1、3、6、10、20滋g/mL米諾環素組骨髓間充質干細胞吸光度分別為0.245依0.054、0.263依0.045、0.458依0.085、0.651依0.102、0.619依0.078和0.239依0.051，各組吸光度平均值不全相等（<0.05）。合適濃度的米諾環素能促進細胞增殖，而隨著米諾環素濃度的提高細胞增殖能力受到抑制。3、6、10滋g/mL米諾環素組骨髓間充質干細胞吸光度明顯高于空白對照組（<0.001），10滋g/mL米諾環素組明顯高于20滋g/mL米諾環素組（<0.001），而空白對照組與1滋g/mL和20滋g/mL米諾環素組比較，6滋g/mL米諾環素組與10滋g/mL米諾環素組比較，差異均無統計學意義（>0.05）。

米諾環素是一種半合成的四環素類廣譜抗生素。研究發現，米諾環素具有良好的抑制炎性反應作用［4］，完全不同于其抗感染的作用機制，臨床上用于類風濕性關節炎等嚴重的人類炎性疾病的治療。此外，米諾環素還發揮神經保護的作用，其可以穩定線粒體膜，降低其通透性，減少細胞色素C釋放，抑制小膠質細胞激活，減少神經元和少突膠質細胞的凋亡［5］。相關研究還顯示［6］，小腦顆粒細胞使用米諾環素處理后再給予N鄄甲基鄄天冬氨酸處理，檢測神經元活力，結果顯示N鄄甲基鄄天冬氨酸處理細胞活力減少35%，米諾環素預處理的細胞未出現細胞活力下降，提示米諾環素對N鄄甲基鄄天冬氨酸誘導的興奮毒性有保護作用。Kumer等［7］在糖尿病大鼠成模4周后給予米諾環素（50mg/kg）和阿司匹林（50mg/kg）口服，連續給藥4周，結果發現，8周病程的干預組糖尿病大鼠腎功能明顯改善。通過以上實驗可以得出米諾環素作用廣泛，作為一種抗生素，它不僅可以很好地抑制炎性反應，還可以保護神經系統、抑制細胞凋亡、保護腎臟功能。

目前骨髓間充質干細胞以其諸多優點已經成為細胞移植理想的種子細胞［8］。但是從嚴格意義上來講，間充質干細胞不具有無限增生的能力，無論在體或者體外，間充質干細胞的增生能力是有限的，而且其增生和進入衰老凋亡的過程受到嚴格的分子機制調控［9］。所以能否找到一種更合適它生長的微環境便顯得尤為重要。本實驗分別在大鼠體內和體外制造米諾環素微環境，來觀察其對骨髓間充質干細胞生長的影響。在48只脊髓損傷的動物模型中，12只聯合治療組大鼠的脊髓損傷中心可以觀察到更多骨髓間充質干細胞，而在體外合適劑量的米諾環素對骨髓間充質干細胞的增殖有一定的促進作用。通過以上的結果，我們可以推測米諾環素對骨髓間充質干細胞的生長起到積極的作用。其可以作為神經系統損傷后骨髓間充質干細胞移植治療的鋪墊和輔助。