蛇毒纖溶酶急性毒性
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【摘要】測定蛇毒纖溶酶的半數致死量（LD50）并研究蛇毒纖溶酶的急性毒性。方法小鼠單次靜脈注射蛇毒纖溶酶，觀察14天內的毒性反應和死亡情況并計算出LD50。結果蛇毒纖溶酶的LD50為24783u/kg，95%可信限為21519～28823u/kg，中毒死亡時間集中在給藥后48h，其毒性靶器官主要是胃、十二指腸、空腸、肺、胰。結論蛇毒纖維蛋白溶解酶具有纖溶藥相同的毒性癥狀，有出血傾向。
【關鍵詞】蛇毒纖溶酶急性毒性半數致死量
【Abstract】ObjectiveTomeasurethemedianlethaldose（LD50）ofnevinfibrinolyticenzymeandinvestigateitsacutetoxicityinmice.MethodsAftersingleintravenousdosing,thetoxicityreactionsandthenumberofdeathsofnevinfibrinolyticenzymewereobservedfor14daysinmice,thentheLD50wascalculated.ResultsTheLD50ofnevinfibrinolyticenzymewas24783u/kg,andits95%confidentintervalwas21519～28823u/kg.Thetargetorganswerestomach,duodenum,jejunum,lungandpancreas.Thedeathfocuson48haftertheadministration.ConclusionNevinfibrinolyticenzymehasthesametoxicityastheotherfibrinolyticenzymes,whichhasbleedingtendency．
【Keywords】nevinfibrinolyticenzyme;acutetoxicity;LD50
蛇毒中含多種具有生物活性的酶、多肽和蛋白質,其特殊的功能已在科學研究和醫療實踐中獲得了廣泛應用。利用蛋白質分離技術從蛇毒中高度純化而得的蛇毒纖溶酶可直接溶解纖維蛋白凝塊，可用于心腦血栓和心肌梗死的治療。近年來未見對蛇毒纖溶酶毒性的研究報道，為此本文對蛇毒纖溶酶急性毒性進行了初步研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1動物NIH小鼠，SPF級，50只，雌雄各半，購自廣東省醫學實驗動物中心［實驗動物合格證號：0026628，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2003-0002，實驗動物監測證號：粵監證字2007A004］。
1.1.2試劑和藥物蛇毒纖溶酶（批號：070274，北京博康寧生物醫藥科技有限公司）；0.9％氯化鈉注射液（批號：060626-07，昆明市宇斯藥業有限責任公司）；甲醛溶液（批號：20061101-11，廣州化學試劑廠）。
1.1.3儀器全密封自動脫水機（ASP300，德國Leica公司）；平推式切片機（MicromMH400，德國Leica公司）；生物組織包埋機（LeicaEG1164，德國Leica公司）；病理圖像分析系統（廣州億鳴公司）。
1.2方法［1,2］選用檢疫合格的NIH小鼠50只，將動物按體重、性別隨機分為5組，每組10只動物（雌雄各半），根據預試結果給藥劑量設定為38000、30400、24320、19456、15565u/kg，給藥容積為0.2ml/10g。給藥后連續觀察4h，如無異常則終止持續觀察，改為每天觀察1次，觀察至給藥后第14天，觀察內容包括：動物外觀體征、行為活動、腺體分泌、呼吸、糞便、給藥局部、動物死亡數量、死亡時間、瀕死前反應等。每組動物分別于給藥前及給藥后1、2、3、7、14天稱體重6次。實驗過程中因瀕死而處死的動物、死亡的動物以及實驗結束時仍存活的動物均進行大體解剖，肉眼觀察主要臟器變化，若有異常均應記錄并進行組織病理學檢查。飼養室溫度與濕度：20～26℃，40%～70%。
1.3統計學分析實驗數據采用平均值±標準差（x±s）表示，兩組間均數比較用t檢驗，按Bliss法計算LD50及95%可信限。
2結果
2.1給藥后毒性反應癥狀及LD50值38000u/kg劑量組動物給藥后即刻出現少動、呼吸急促的現象，然后趴臥不動，約30min后有6只小鼠死亡，1只小鼠在給藥后約1h死亡，3只小鼠在給藥后約3h死亡，該劑量組動物死亡前主要反應為陣攣性抽搐、全身震顫、角弓反張、翻正反射消失，其中有2只動物鼻腔出血。30400u/kg劑量組動物給藥后即刻亦出現少動、呼吸急促的現象，有4只動物在給藥6h內死亡，動物死亡前主要反應為陣攣性抽搐、全身震顫以及腹式呼吸。本組2只動物在給藥后第2日死亡。24320、19456、15565u/kg劑量組動物給藥后即刻出現少動、呼吸急促的現象，大部分動物約10min后恢復正常，動物死亡發生在藥后48h內。從藥后第3天到藥后第14天，幸存動物活動狀況良好，無異常表現。各組動物死亡時間分布情況見表1。用Bliss法計算蛇毒纖維蛋白溶解酶單次靜脈注射給藥NIH小鼠的LD50為24783u/kg，95%可信限為21519～28823u/kg，見表2。表1NIH小鼠單次靜脈注射蛇毒纖維蛋白溶解酶后死亡情況分布表表2NIH小鼠單次靜脈注射蛇毒纖維蛋白溶解酶的LD50測定（Bliss法）
2.2體重變化靜脈注射給藥后第1天除15565u/kg劑量組動物體重維持在給藥前水平外，其余各劑量組動物均出現體重下降現象。從給藥后第2天開始，各劑量組幸存動物體重逐漸增長，且體重增加幅度相近，見表3。表3NIH小鼠單次靜脈注射蛇毒纖維蛋白溶解酶后體重變化情況
2.3病理組織學檢查結果蛇毒纖維蛋白溶解酶各劑量組給藥后死亡和瀕死的動物剖檢發現胃近幽門部、腸系膜、十二指腸、空腸、肺、胰均有出血和充血的現象，對這些異常的組織臟器進行組織病理學檢查可見：肺臟間質均出現彌漫性大量紅細胞，支氣管周圍間質更為嚴重，有的還可見溶解的紅細胞，為急性肺出血。胰腺出現不同程度的出血，胰腺小葉間質較寬，并可見有數量不等的紅細胞，有的還可見溶解的紅細胞。胃出現不同程度出血，胃黏膜層、黏膜下層可見數量不等的紅細胞。十二指腸出現不同程度出血，十二指腸黏膜固有層、黏膜下層可見數量不等紅細胞，部分動物十二指腸黏膜固有層出現輕度水腫。回腸出現輕度出血，回腸黏膜固有層、黏膜下層可見少量紅細胞，部分動物回腸黏膜固有層出現輕度水腫。給藥后第14對存活的動物進行大體解剖，各劑量組動物胰腺、十二指腸、空腸及腸系膜、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腦等主要臟器均未發現有異常改變。
3討論
凝血中形成的纖維蛋白，可經纖溶酶作用從精氨酸-賴氨酸鍵上分解成可溶性產物，使血栓溶解。纖維蛋白溶解藥激活纖溶酶而促進纖溶，也稱溶栓藥。其嚴重不良反應為出血傾向，以注射或穿刺局部血腫最為常見，其次為組織內出血。因為被激活的纖溶酶不但溶解病理性纖維蛋白，也溶解生理性的纖維蛋白［3］。
在本實驗條件下，蛇毒纖維蛋白溶解酶單次靜脈注射的毒性癥狀與其他纖溶藥相同，有出血傾向，其毒性靶器官主要是胃、十二指腸、空腸、肺、胰，本藥未發現其他特異的癥狀。蛇毒纖維蛋白溶解酶毒性反應集中在給藥后24h，中毒死亡時間集中在給藥后48h。NIH小鼠尾靜脈單次給藥的LD50為24783u/kg，95%可信限為21519～28823u/kg。
【參考文獻】
1化學藥物急性毒性試驗技術指導原則課題研究組．化學藥物急性毒性試驗技術指導原則,2005,3.
2袁伯俊，王治喬．新藥臨床前安全性評價與實踐．北京：軍事醫學科學出版社，1997，27-28.
3楊藻宸.藥理學和藥物治療學.北京：人民衛生出版社,2000，1009-1011.
