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      mRNA差異顯示進展

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      mRNA差異顯示進展

      哺乳動物細胞約有100?000個不同的基因,在一定時間、空間中僅有10%~15%的基因表達,這種表達受到嚴格調控[1]。運用mrna差異顯示(differentialdisplay,DD)方法[2],可將不同細胞類型或同一細胞在不同環境下表達的基因進行比較,從分子生物學水平上提供信息,這對理解細胞的生命過程極有幫助。該技術一經問世,立即得到廣泛應用,但同時也遇到許多問題,所以Debouck[3]曾對該方法提出質疑。現將DD的研究進展簡要綜述如下。

      一、DD方法基本原理

      DD的基本原理是將具有可比性的細胞在某一條件下可表達的mRNA群體通過逆轉錄方法變成相應的cDNA群體,以此為模板,利用一對特殊引物,即3anchor引物和5arbitrary引物,在一定條件下進行PCR擴增,得到與mRNA相對應的“標簽”(tags),然后用變性聚丙烯酰胺測序膠分析其差別,將有差別的基因克隆化,進一步分析其結構與功能。DD依賴三種技術:(1)mRNA逆轉錄技術;(2)以特定引物進行的PCR技術;(3)DNA測序膠電泳技術。

      二、DD方法的優點及其應用

      用某一方法來尋找mRNA表達的差異,至少要滿足下列要求:(1)在一定時間、空間里,每一個細胞約有15000種mRNA表達,其中除少數屬高豐度表達外,大量的屬于低豐度表達,即要求使用的方法足以顯示低豐度mRNA;(2)重復性要好;(3)實驗過程中能夠步步驗證比較(side-by-sidecomparison);(4)得到的產物能代表相應的mRNAs或cDNAs,并能由此找到相應的cDNA序列;(5)省時,簡便易行。

      既往對mRNA的比較研究中多用減數雜交方法[4](subtractionhybridization),該方法靈敏,可顯示低豐度RNA,但是步驟復雜,需時較長,而且在得到最終結果前無法步步驗證對照比較,故不易重復,并且需要大量的RNA作起始研究材料。這一點對RNA來源不易者(如手術活檢標本)極不利[5,6]。

      DD的優點在于:(1)僅需0.2μg總RNA作為起始材料;(2)可同時分析多組樣品;(3)敏感性高,可檢出低豐度mRNA;(4)實驗周期短,約8天即可完成[7],便于重復;(5)最突出的優點是實驗過程中可步步驗證比較。可簡單地將DD的特點概括為“3SRV”,即“Simplicity,Sensitivity,Speed,Reproducibility,Versatility”。

      DD方法因有上述優點,被廣泛應用。例如:Musholt等[8]應用DD方法對手術切下的髓樣甲狀腺癌標本與局部轉移的淋巴結進行了比較,發現了兩個新的表達基因MDF-1和MDF-2,并認為這兩個基因在髓樣甲狀腺癌的進展與轉移中起了重要作用;Zuo等[9]研究潰瘍性結腸炎的粘膜細胞,以正常結腸粘膜細胞作對照,找到了25個表達基因,其中有些與甲狀旁腺瘤、T細胞受體-β、卵巢癌等表達的基因同源。

      關于神經再生問題,Livesey等[10]發現了Reg-2基因,并認為該基因是哺乳類動物運動神經元再生的關鍵基因。

      在骨科領域,也有許多用DD方法的研究,Ryoo等[11]找到了一個與成骨細胞表型發育有關的細胞增殖標志基因PROM-1(proliferatingcellmarker)。更令人鼓舞的是,Boden等[12]用一種新的骨形成蛋白LMP-1基因轉染骨髓細胞,再作局部基因治療,在動物實驗中成功地進行了脊柱融合,LMP-1基因就是用DD方法克隆出來的。

      此外,DD還應用于心血管病[13]、糖尿病[14]、胚胎發育[15]、先天性疾病[16]以及藥理學[17]和眼科學[18]等。不僅用于動物和人類,還應用于植物分子生物學研究[19]。

      三、存在的問題與對策

      DD方法存在的問題概括起來有兩方面:一是假陽性多(約50%~70%),二是得到的有差異cDN段短(約為110~500bp)。因為這兩個問題,使許多研究者踟躕不前,這也是Debouk[3]提出質疑的原因之一。

      產生假陽性的原因,在于以下4個環節:(1)提取總RNA時,有染色體DNA污染,此DNA作為模板在PCR過程中被擴增;(2)從聚丙烯酰胺膠上挑選有差異條帶時,實驗組與對照組間信號對比不夠顯著;(3)在克隆階段挑選陽性菌落時,未能排除基因克隆中的假陽性;(4)研究中多次使用PCR技術,很難避免實驗室環境中的交叉污染。

      解決這一問題的對策是:(1)提取RNA操作嚴格,得到的RNA必須經過脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)充分消化,去除染色體DNA污染。(2)從聚丙烯酰胺膠上切取有差異條帶時,首選實驗與對照間信號差異顯者,最好是互為有或無的關系;如果僅僅是強與弱的關系,放在次選位置上。(3)即使是差異顯著地顯現為一條帶,也不能肯定是由某一cDNA的均一分子泳動而成,有可能是結構不同而分子量相同的cDNA共泳動(Co-migrat)的結果。對此,可用mSSCP方法區別開來[7]。也可在基因克隆挑選時,用ReverseNorthern原理作菌落原位雜交進行篩選[20]。(4)關于交叉污染問題的克服應服從分子生物學一般原則。(5)有差異基因的最終確認是用Northern雜交,如果選取了十幾或幾十條差異條帶,用Northern雜交工作量太大,若用ReverseNorthern雜交則比較簡便[20]。

      DD擴增片段較短(≤500bp),且擴增片段多位于3UTR(3untranslatedregion)范圍內,很少能擴增到ORF(openreadingframe)范圍內。這一缺點是由使用的特殊引物所決定的,因此DD得到的是mRNA的標簽(tags);由此帶來另一個問題,即這一位于3UTR范圍的標簽與GeneBank數據庫比較時,多數情況是與EST(expressionseguencetags)比較,常不能滿足研究者的要求。

      解決這一問題的對策是:(1)應用TargetedDD方法,基本原理是將5端引物延長,增加擴增片段的特異性[21,22];或者用Stone和Wharton[23]報道的“targetedRNAfingerprinting”方法。這樣有可能使擴增片段特異性高,減少假陽性率,同時可能在GeneBank數據庫中得到更多結構與功能方面的信息;(2)用得到的cDN段作probe篩選相應cDNA文庫,得到cDNA全序列,以便于基因結構與功能研究。

      四、展望

      了解細胞在某一條件下的基因表達,對闡明生命過程(如生長發育與分化、細胞凋亡與衰老等生理過程)以及炎癥、腫瘤、心腦血管疾病等病理過程極為重要。DD方法在應用中被不斷完善,同時也有更新的技術問世,如DNAmicroarrays[24],把大量寡核苷酸片段排列在相似于一種大規模集成電路式的生物芯片上,一次可完成數量相當可觀的反應,提供的信息是目前所有基因表達研究技術不可比擬的。但是,該方法在反應信號檢測與數據處理等方面需要昂貴設備,比較起來,DD方法還是有其優越性,如果實驗設計合理,技術應用得當,相信對分子生物學研究有幫助。

      參考文獻

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