聯(lián)系人意見

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聯(lián)系人意見范文第1篇

為認(rèn)真貫徹實(shí)施國務(wù)院《工傷保險(xiǎn)條例》，進(jìn)一步提高工傷認(rèn)定的準(zhǔn)確性，有效落實(shí)法律監(jiān)督制度，做好工傷認(rèn)定及其行政復(fù)議、行政訴訟工作，根據(jù)市政府辦公室《關(guān)于建立市工傷認(rèn)定工作聯(lián)席會議制度的通知》要求，經(jīng)區(qū)政府同意，建立區(qū)工傷認(rèn)定工作聯(lián)席會議制度。現(xiàn)就有關(guān)問題通知如下：

一、聯(lián)席會議的主要職能

聯(lián)席會議由牽頭部門召集成員單位學(xué)習(xí)、交流工傷認(rèn)定有關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章和政策規(guī)定，分析研究復(fù)雜和疑難工傷認(rèn)定案件，探討有共性的工傷案例，就成員單位需要配合的事項(xiàng)進(jìn)行溝通。通過對工傷認(rèn)定及其行政復(fù)議、行政訴訟案件的溝通協(xié)商，總結(jié)執(zhí)法、司法實(shí)踐中的經(jīng)驗(yàn)做法，形成指導(dǎo)性意見，指導(dǎo)工作開展。在工傷認(rèn)定及其行政復(fù)議、行政訴訟的調(diào)查處理過程中，對律師等法律工作者的從業(yè)行為和當(dāng)事人行為進(jìn)行引導(dǎo)約束。

二、聯(lián)席會議成員單位及其職責(zé)

聯(lián)席會議成員單位由區(qū)人力資源和社會保障局、區(qū)政府法制局、區(qū)法院、區(qū)公安分局、區(qū)司法局、區(qū)安監(jiān)局、區(qū)衛(wèi)生局組成。聯(lián)席會議辦公室設(shè)在區(qū)人力資源和社會保障局，具體負(fù)責(zé)聯(lián)席會議的牽頭召集及日常工作。

區(qū)人力資源和社會保障局負(fù)責(zé)工傷認(rèn)定復(fù)雜和疑難案件的整理，對有關(guān)法律、法規(guī)和規(guī)章規(guī)定不具體或?qū)l文理解不一致的情況進(jìn)行匯總分析，提交聯(lián)席會議討論，對聯(lián)席會議研究確定的意見及時(shí)反饋有關(guān)部門。

區(qū)政府法制局負(fù)責(zé)對適用行政法規(guī)有關(guān)內(nèi)容的解釋，在審理工傷認(rèn)定行政復(fù)議案件提出擬辦意見前，及時(shí)與區(qū)人力資源和社會保障局進(jìn)行溝通。

區(qū)公安分局負(fù)責(zé)對工傷認(rèn)定中涉及交通事故、人身傷害、刑事案件等情況給予協(xié)助，依法出具相關(guān)證明材料；對有關(guān)法規(guī)條文提出指導(dǎo)性解釋。

區(qū)司法局負(fù)責(zé)對有關(guān)工傷認(rèn)定案件的律師等法律工作者進(jìn)行管理考核；會同區(qū)人力資源和社會保障局通報(bào)律師等法律工作者工傷案件的從業(yè)情況，規(guī)范律師等法律工作者的從業(yè)行為。

區(qū)安監(jiān)局負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)督導(dǎo)全區(qū)安全生產(chǎn)行政執(zhí)法工作，依法行使綜合監(jiān)督管理職權(quán)，組織查處職業(yè)危害事故和違法違規(guī)行為；綜合管理全區(qū)生產(chǎn)安全傷亡事故和安全生產(chǎn)行政執(zhí)法統(tǒng)計(jì)分析工作；指導(dǎo)全區(qū)安全生產(chǎn)宣傳教育、安全生產(chǎn)監(jiān)督管理人員的安全培訓(xùn)、考核工作。

三、工作規(guī)則

聯(lián)系人意見范文第2篇

關(guān)鍵詞:未成年人;學(xué)校與社區(qū);思想道德

當(dāng)前加強(qiáng)未成年人思想道德建設(shè)是每個(gè)學(xué)校的重中之重。眾所周之，未成年人能否健康成長直接關(guān)系到一個(gè)國家、一個(gè)民族的興衰，未成年人是國家的未來、民族的希望，黨和國家歷來都非常重視對未成年人的教育、引導(dǎo)和保護(hù)，并為未成年人的健康成長創(chuàng)造良好的條件和環(huán)境。今年我市教育局也提出:讓德育回歸生活，培養(yǎng)有文化有素養(yǎng)的文明公民。因此，要把未成年人思想道德建設(shè)放在學(xué)校的首要位置上來抓，將文化育人作為學(xué)校德育的最高境界和目標(biāo)，以校園文化建設(shè)為突破口，更新教育教學(xué)觀念，打造一支高素質(zhì)的教師隊(duì)伍，提高教育教學(xué)質(zhì)量，營造一個(gè)良好的育人環(huán)境，為教師發(fā)展和學(xué)生成長創(chuàng)造適合的文化氛圍。

一、加強(qiáng)學(xué)校與社區(qū)的聯(lián)系

社區(qū)是以家庭和各個(gè)單位為細(xì)胞的組織體，是學(xué)校和家庭存在的生活空間，更是學(xué)生成長和發(fā)展的寶貴資源庫。社區(qū)環(huán)境直接影響著家庭和學(xué)校的教育教學(xué)質(zhì)量，社區(qū)環(huán)境是以一定區(qū)域內(nèi)社會共同體所反映出來的有關(guān)人的行為方式、社會習(xí)俗、生活方式、價(jià)值觀念、思維定式、地域形態(tài)等文化現(xiàn)象的總和。社區(qū)文化環(huán)境建設(shè)水平的高低、質(zhì)量的好壞是衡量一個(gè)民族文化教育素質(zhì)高低的重要標(biāo)志。而學(xué)校的基本社會功能是專門從事教育的機(jī)構(gòu)，有傳遞社會文化、促進(jìn)個(gè)體社會化的責(zé)任與義務(wù)。可見學(xué)校與社區(qū)在文化上的同一性受到重視，學(xué)校被看成是社會文化層次中的一個(gè)亞單元。學(xué)校在傳遞某種理想的背后，其組織方式、人際互動(dòng)方式、價(jià)值取向和傳播方式都與它所在的社區(qū)具有相同的一面，社區(qū)上各種影響都會在學(xué)校中得到反映。

二、加強(qiáng)教師與家長的聯(lián)系

眾所周之，家長是孩子的第一任教師、是孩子的啟蒙教師，父母在子女面應(yīng)該是寬厚的長輩、淵博的老師、親密的朋友，并且家庭是孩子成長的搖籃，是最直接的道德實(shí)踐的地方，家庭道德教育的作用是其他渠道無可替代的。首先家長要有必備的基本知識，因?yàn)楦改甘呛⒆拥牡谝蝗卫蠋?其次，家庭中的成年人尤其是未成年人的父母親要為未成年人做出道德表率和模范作用，因?yàn)楦改赣H的一言、一行、一舉、一動(dòng)都在影響著孩子，對孩子有著潛移默化的作用。

誠然，學(xué)校、教師與家庭的合力關(guān)系也是不能忽視的，前蘇聯(lián)著名的教育家蘇霍姆林斯基就說過:“學(xué)校和家庭是一對教育者。”這就道出了在教育中教師與家長的合力關(guān)系。素質(zhì)教育是一個(gè)合力效應(yīng)，學(xué)校、教師、家庭三者缺一不可。因此，必須加強(qiáng)家長與學(xué)校、與老師的溝通，爭取家長對學(xué)校教育的理解與支持，讓家長了解學(xué)校，融入學(xué)校，信任學(xué)校，最終實(shí)現(xiàn)學(xué)校教育的和諧化，使學(xué)校教育和家庭教育同步協(xié)調(diào)，促進(jìn)學(xué)校發(fā)展朝著“讓社會放心、讓家長滿意、讓學(xué)生喜歡”的目標(biāo)邁進(jìn)。

三、加強(qiáng)家長與孩子聯(lián)系

親子關(guān)系是一種最先存在于孩子與父母之間的一種人際關(guān)系，這種關(guān)系是其他關(guān)系無可取代的。而和諧的親子關(guān)系是每個(gè)家庭的幸福。父母與孩子間關(guān)系的融洽是家庭和諧的表現(xiàn)，也是社會和諧的基礎(chǔ)，親子關(guān)系的好壞，不僅直接影響孩子的身心發(fā)展與健康，而且也將影響到孩子以后形成的各層次的人際交往關(guān)系。

四、加強(qiáng)教師與學(xué)生之間的聯(lián)系

俗話說得好:“理解萬歲”。師生之間的理解是校園和諧的根本，而構(gòu)建和諧校園是構(gòu)建和諧教育的重要組成部分，這就要求師生之間要加強(qiáng)聯(lián)系與溝通。當(dāng)前，素質(zhì)教育正在我國全面鋪開與深入，師生之間的角色也在轉(zhuǎn)變。新型的師生關(guān)系是一種親密的和諧的朋友關(guān)系，師生和諧是校園的根本，是學(xué)校和學(xué)生發(fā)展的共同基礎(chǔ)。師生和諧是學(xué)生得以健康成長和良好發(fā)展的前提和關(guān)鍵，也是幫助教師樹立正確的學(xué)生觀、質(zhì)量觀，實(shí)現(xiàn)專業(yè)化發(fā)展的理想境界。因此，這就要求我們要加強(qiáng)“師德師風(fēng)”教育、加強(qiáng)教師職業(yè)道德規(guī)范教育，通過這些活動(dòng)促使教師角色的轉(zhuǎn)變，促使教師遵守職業(yè)道德、提升師德水平和業(yè)務(wù)素質(zhì)，不斷增強(qiáng)“教書育人、管理育人、服務(wù)育人”的使命感和責(zé)任感，在育人過程中不斷增進(jìn)師生之間的和諧情誼。

總之，未成年人思想道德建設(shè)的教育是一項(xiàng)十分復(fù)雜的工程，未成年人思想道德教育不是單方的教育，單靠學(xué)校是不行的，單靠家庭也是不夠的，單靠社會也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，我們必須形成一個(gè)合力，需要多方面的共同努力，構(gòu)建一個(gè)德育網(wǎng)絡(luò)，齊抓共管，發(fā)揮一切能夠發(fā)揮的力量，這樣教育才能夠發(fā)揮應(yīng)有的作用。相信只要我們家長、學(xué)校、社會和教師不懈地努力，未成年人的思想道德教育將會取得更大的成效。

聯(lián)系人意見范文第3篇

“崗樹一念”，樹立起符合科學(xué)發(fā)展觀要求的崗位理念

要求每個(gè)工作崗位都要按照科學(xué)發(fā)展觀的要求，創(chuàng)新崗位理念，使每名工作人員在先進(jìn)理念指導(dǎo)下做好本職工作。綜合調(diào)研工作確立了“說真話、說實(shí)話、敢說話，謀難點(diǎn)、謀突破、謀創(chuàng)新”的理念；信息工作確立了“參謀決策助手，黨和群眾紐帶”的理念；督查工作確定了“鐵面無私，雷厲風(fēng)行”的理念；干部工作確立了“忠誠服務(wù)，凝心聚才”的理念；值班工作確立了“準(zhǔn)確到位，第一時(shí)間”的理念，保密工作確立了“國家秘密忠誠衛(wèi)士”理念，機(jī)要工作確立了“黨的忠誠傳令兵”的理念等等。在此基礎(chǔ)上，辦公廳綜合歸納了四個(gè)理念，作為對全廳同志的統(tǒng)一要求：一是以人為本，抓班子、帶隊(duì)伍，關(guān)心人、培養(yǎng)人、成就人，充分調(diào)動(dòng)全廳黨員干部職工的積極性、主動(dòng)性和創(chuàng)造性；二是超前謀劃，變被動(dòng)為主動(dòng)，參謀在前、策劃在前、行動(dòng)在前；三是改革創(chuàng)新，創(chuàng)新服務(wù)方式，創(chuàng)新思路舉措，創(chuàng)新工作方法；四是快捷高效，第一時(shí)間獲得真實(shí)信息，第一時(shí)間做出反應(yīng)，第一時(shí)間謀劃出方案，第一時(shí)間推動(dòng)落實(shí)。

“人練一招”，練就在本職崗位上服務(wù)科學(xué)發(fā)展的過硬本領(lǐng)

按照提高效率、優(yōu)質(zhì)服務(wù)的要求，強(qiáng)化崗位練兵，打牢基本功，熟練掌握過硬的業(yè)務(wù)本領(lǐng)。如文字工作人員著力提高迅速成稿能力和核稿改錯(cuò)能力；事務(wù)工作人員著力提高準(zhǔn)確復(fù)述領(lǐng)導(dǎo)交辦事項(xiàng)、電話內(nèi)容等，迅速做出擬辦意見，熟記電話號碼、傳真號、車號等方面的能力；資料工作人員著力提高迅速提供上情下情，各種數(shù)據(jù)的能力。通過“人練一招”活動(dòng)的開展，在辦公廳全體同志中興起了“學(xué)業(yè)務(wù)、長本領(lǐng)”的熱潮，大家比、學(xué)、趕、超，業(yè)務(wù)素質(zhì)有了明顯提升，在本職崗位上服務(wù)科學(xué)發(fā)展的本領(lǐng)得到了進(jìn)一步增強(qiáng)。

“處謀一策”，積極為推進(jìn)全市科學(xué)發(fā)展出謀劃策

聯(lián)系人意見范文第4篇

【摘要】 目的: 建立一種高效擴(kuò)增人T細(xì)胞受體（TCR）β鏈可變區(qū)（Vβ）基因的方法。方法: 根據(jù)TCR Vβ26個(gè)亞家族基因序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增Vβ基因的上游內(nèi)引物34條、 上游外引物37條， 并將內(nèi)、 外上游引物各分為8個(gè)簡并組。在恒定區(qū)（C區(qū)）設(shè)計(jì)下游內(nèi)、 外和測序引物各1條以及擴(kuò)增Cβ基因的上游引物1條。提取細(xì)胞RNA， 用PolyA介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄后， 采用巢式PCR擴(kuò)增正常人CD8 T細(xì)胞TCR Vβ26個(gè)亞家族基因， 并用Jurkat T淋巴瘤細(xì)胞作為對照。用Teasy載體克隆RTPCR 產(chǎn)物， 對克隆基因進(jìn)行測序。結(jié)果: 從正常人的CD8 T細(xì)胞中擴(kuò)增到所有TCR Vβ亞家族基因， 克隆后測序與相應(yīng)的參考序列同源。從Jurkat細(xì)胞擴(kuò)增出TCR Vβ8基因， 經(jīng)測序驗(yàn)證與文獻(xiàn)報(bào)道一致， 且最少可從10個(gè)細(xì)胞提取的RNA模板中擴(kuò)增成功。結(jié)論: 建立的巢式RTPCR方法可以高效、 廣譜地?cái)U(kuò)增人TCR Vβ基因， 為進(jìn)一步進(jìn)行抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 CD8 T細(xì)胞; T細(xì)胞受體（TCR）; 反轉(zhuǎn)錄PCR; 基因克隆

［Abstract］ AIM: To develop an effective assay for amplifying human Tcell receptor (TCR) variable region of β chain (Vβ)encoding genes. METHODS: Based on the property of the 26 subfamilies of human TCR Vβencoding gene sequence， 34 sets of outer and 37 sets of inner sense primers were pided into 8 degenerate primer groups， and a set of outer and inner antisense primers located in conserved region β chain (Cβ) was designed for the amplification of the TCR Vβencoding genes. In addition， a sequencing primer and a sense primer for amplifying Cβencoding genes were designed. CD8 Tcell RNA was extracted and subjected to reverse transcription mediated by poly A， followed by a nested polymerase chain reaction (PCR) to amplify the 26 subfamilies of human TCR Vβencoding genes. Jurkat T lymphoma cells were used as control. Teasy vector was employed to detect DNA sequencing of the cloned target genes. RESULTS: All the subfamilies of the Vβencoding genes were obtained from CD8 T cells of a healthy donor， except the subfamily of Vβ8 ， was obtained from Jurkat cells. The results were confirmed by DNA sequencing of the cloned genes. CONCLUSION: The nested RTPCR assay can effectively amplify human TCR Vβencoding genes with broad spectrum， which is helpful for the cloning and functional study of the TCR expressed by antigenspecific cytotoxic T lymphocytes.

［Keywords］CD8 T cell; Tcell receptor (TCR); RTPCR; gene cloning

T細(xì)胞受體（Tcell receptor， TCR）是T細(xì)胞表面特異性識別抗原和介導(dǎo)免疫應(yīng)答的分子， 可分為TCRα/β和TCRγ/δ兩種類型， 外周血T細(xì)胞主要為TCRα/β的T細(xì)胞， 是介導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞。TCRβ基因由可變區(qū)（V）、 多變區(qū)(D)、 結(jié)合區(qū)（J）和恒定區(qū)（C）四部分基因片段組成。在T細(xì)胞發(fā)育過程中V區(qū)、 D區(qū)和J 區(qū)進(jìn)行重排而形成具有功能的TCR編碼基因， 重排的過程中VD和DJ 之間可有不同數(shù)量的核苷酸隨機(jī)插入或刪減的現(xiàn)象， 這種基因片段連接的不準(zhǔn)確性使TCR的表達(dá)呈多樣性， 以識別各種不同的抗原［1］。因此， 分析TCR Vβ亞家族的表達(dá)和利用情況， 對闡明腫瘤、 自身免疫性疾病以及病毒感染等疾病的致病機(jī)制十分重要［2-4］。然而由于TCR Vβ的多樣性， 采用已往報(bào)道用的RTPCR方法在T細(xì)胞數(shù)量很少以及TCR表達(dá)很微量的情況下擴(kuò)增TCR基因靈敏度不高或代表性不夠。本研究通過優(yōu)化引物設(shè)計(jì)和應(yīng)用巢式RTPCR使TCR Vβ的擴(kuò)增具有很高的靈敏度和廣泛的代表性。PCR產(chǎn)物進(jìn)一步做DNA克隆， 挑取單克隆菌落測序， 了解TCR Vβ鏈的表達(dá)和分布情況， 為進(jìn)一步研究病毒感染時(shí)特異性T細(xì)胞TCR的偏性取用（bias usage）和克隆性增殖的情況提供了方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 用于分選CD8 T細(xì)胞的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）來自1例男性健康成年人， Jurkat 淋巴瘤細(xì)胞為本室保存， MACS（Magnetic activated cell sorter）磁珠分選CD8 T細(xì)胞的試劑與分離柱和分離器購自德國Miltenyi Biotec公司， 熒光標(biāo)記的抗CD3和抗CD8抗體購自美國BDPharmingen公司， 提取細(xì)胞RNA的RNessy mini盒、 PCR產(chǎn)物回收和凝膠電泳產(chǎn)物回收試劑盒均購自德國Qiagen公司， 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pGEM Teasy 載體均購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 PBMC分離和CD8 T細(xì)胞分選 按照常規(guī)方法分離PBMC， CD8 T細(xì)胞的MACS磁珠分選操作方法按說明書進(jìn)行。分選后的CD8 T細(xì)胞用熒光標(biāo)記的抗CD3和抗CD8抗體染色、 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測CD8 T細(xì)胞的純度和數(shù)量， 用RPMI1640液調(diào)整細(xì)胞密度至 2×109/L備用。

1.2.2 引物 根據(jù)文獻(xiàn)資料［5， 6］和從GenBank下載的257條人TCR Vβ基因序列進(jìn)行分析， 根據(jù)Vβ各個(gè)亞家族的基因序列特點(diǎn)， 在相對保守的信號肽區(qū)設(shè)計(jì)出相應(yīng)的25個(gè)亞家族特異性上游引物(Vβ26亞家族基因?yàn)榧倩颍?故不設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn))， 因?yàn)橛行㏕CR Vβ亞家族內(nèi)部還分為幾個(gè)不同的分家族， 故共設(shè)計(jì)了上游外引物34條和上游內(nèi)引物37條; 在Cβ區(qū)設(shè)計(jì)下游外引物down1、 下游內(nèi)引物down2、 測序引物down3各1條， 以及擴(kuò)增Cβ基因的上游引物C1（表1）。引物由上海生工公司合成。表1 擴(kuò)增TCR Vβ和Cβ編碼基因的引物設(shè)計(jì)

1.2.3 RNA提取和巢式RTPCR反應(yīng) CD8 T細(xì)胞或Jurkat細(xì)胞RNA的提取按照文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行。應(yīng)用(oligo)dT引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈， 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為40℃ 1 h。以cDNA為第1輪PCR反應(yīng)模板， 將上游外引物分為8組簡并引物分別與down1進(jìn)行8個(gè)PCR反應(yīng)， PCR擴(kuò)增總體積為25 μL/管， 反應(yīng)條件為94℃ 5 min; 94℃ 30 s， 59℃ 30 s（每個(gè)循環(huán)遞減1℃）， 55℃ 30 s， 72℃ 1 min， 30個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min; 68℃ 5 min。第2輪PCR反應(yīng)以第1輪PCR產(chǎn)物為模板， 將對應(yīng)的8組簡并上游內(nèi)引物分別與down2加入各反應(yīng)管中， 反應(yīng)體積為50 μL/管， 反應(yīng)條件為94℃ 3 min; 94℃ 30 s， 60℃ 1 min， 72℃ 1 min， 40個(gè)循環(huán); 72℃ 5 min; 68℃ 5 min; Jurkat細(xì)胞RNA模板擴(kuò)增基因片段長度為578 bp。一些實(shí)驗(yàn)中， 第2輪PCR反應(yīng)使用單一上游引物分管反應(yīng)， 以確定各亞家族引物的擴(kuò)增效率。同時(shí)擴(kuò)增βactin和TCR Cβ編碼基因做為質(zhì)控對照。RTPCR反應(yīng)擴(kuò)增TCRβ鏈編碼基因的步驟示意見圖1。

1.2.4 DNA克隆 PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠（溴乙錠染色）中進(jìn)行電泳分析， 挑取Vβ14亞家族基因的PCR產(chǎn)物做DNA克隆， 切取目的基因片段， 回收PCR產(chǎn)物， 與pGEM Teasy 載體連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌JM109， 氨芐青霉素和Xgal 藍(lán)白斑法篩選陽性菌落， 挑取15個(gè)單克隆白色菌落于10 μL H2O中 94℃加熱10 min以裂解菌體后， 按第2輪PCR體系進(jìn)行PCR反應(yīng)， PCR經(jīng)電泳鑒定后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序， 測序引物為down3。

1.2.5 序列對比 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)序列號， 應(yīng)用Vector NTI 軟件的AlignX組件以及Virusblast軟件， 將本實(shí)驗(yàn)所測的TCRVβ編碼基因序列與已知各種TCR Vβ編碼基因參考序列進(jìn)行比對。

2 結(jié)果

2.1 RTPCR擴(kuò)增TCRβ鏈編碼基因 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和用8組簡并上游引物和下游引物介導(dǎo)二輪PCR擴(kuò)增后， Jurkat細(xì)胞樣本只有在含Vβ8亞家族引物的4B組擴(kuò)增到了目的條帶， 測序結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致， 為Vβ8; CD8 T細(xì)胞在分選后純度為95.9%， 樣本在8組中均擴(kuò)增出目的條帶（圖2B）; 用各種單一引物進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)時(shí)所有亞家族引物均可獲得擴(kuò)增條帶， 圖2B顯示了以第1組上游簡并引物介導(dǎo)的第1輪PCR產(chǎn)物為模板， 第2輪中采用同組5種單一上游引物擴(kuò)增的結(jié)果。βactin和Cβ編碼基因經(jīng)一輪PCR擴(kuò)增即可獲得目的條帶（圖片未顯示）。圖2A顯示用含Vβ8亞家族引物的第4組簡并PCR引物， 分別以1 000個(gè)、 100個(gè)、 10個(gè)Jurkat細(xì)胞提取RNA的為模板， 經(jīng)巢式RTPCR擴(kuò)增的結(jié)果。

2.2 基因克隆和序列分析 Vβ擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)與Teasy載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌， 經(jīng)含氨芐青霉素、 Xgal和IPTG的平板篩選后， 隨機(jī)挑出了15個(gè)克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR和DNA序列分析。本研究的15個(gè)克隆序列與Vβ14參考序列的同源性均達(dá)到75%以上， 15個(gè)克隆的序列差異均主要在CDR3高變區(qū)， 保守區(qū)的序列均一致。

3 討論

T細(xì)胞的特異性由TCR決定， 參與特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的CD8 T細(xì)胞主要是TCRα/T細(xì)胞 ， 其多樣性和特異性產(chǎn)生于TCR受體α和 鏈基因的VDJ重排。TCRα、 鏈的V區(qū)約含102～109個(gè)氨基酸， 由二個(gè)半胱氨酸形成鏈內(nèi)二硫鍵， 組成約含50～60氨基酸殘基的環(huán)肽， 是特異性識別外來抗原的結(jié)構(gòu)域［8］。根據(jù)核苷酸序列同源性 75%的原則， α鏈分屬32個(gè)亞家族， 鏈分屬26個(gè)亞家族， 一些亞家族內(nèi)還包括若干個(gè)分家族。TCRα 的種類約有107， 是從大約108個(gè)不同的TCRα異質(zhì)雙聚體天然前體池（pool of naive precursors）中選擇出來的， 估計(jì)其代表的多樣性>1018［3， 9］。正常情況下PBMC應(yīng)能表達(dá)所有Vβ亞家族基因， 不同的Vβ亞家族T細(xì)胞所執(zhí)行的功能有所不同， 在一些疾病中CD8 T細(xì)胞中的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL）TCR Vβ表達(dá)譜可發(fā)生特有改變。我們曾對中國人群流行的乙型肝炎病毒（HBV）特異性CTL的表位特點(diǎn)進(jìn)行了分析［10］， 如能進(jìn)一步解析特異性CTL的TCR取用特點(diǎn)， 對闡明機(jī)體抗HBV特異性免疫應(yīng)答機(jī)制將有重要意義， 同時(shí)克隆特異性CTL的優(yōu)勢TCR編碼基因可用于抗HBV感染的基因治療研究。

本研究擬在建立一種高效靈敏的TCR Vβ編碼基因擴(kuò)增方法。有報(bào)道采用24條引物介導(dǎo)RTPCR反應(yīng)擴(kuò)增24個(gè)TCR Vβ亞家族編碼基因， 觀察到TCR Vβ亞家族表達(dá)的不均衡性。但該方法要求用于擴(kuò)增的細(xì)胞模板量較高， 擴(kuò)增的各種Vβ亞家族編碼基因片段大小差異較大， 且有少數(shù)TCR Vβ亞家族編碼基因未能檢出［11， 12］。為了能更廣泛地覆蓋Vβ各亞家族/分家族基因的差異序列， 同時(shí)獲得長片段的各個(gè)Vβ亞家族編碼基因， 我們設(shè)計(jì)了兩組上游引物分別為34條外引物和37條內(nèi)引物， 采用巢式RTPCR技術(shù)， 保障了方法的序列兼容性和敏感性; 采用8組簡并上游引物（每組含45個(gè)引物）進(jìn)行反應(yīng)， 再根據(jù)情況在第2輪PCR中采用單一引物， 有利于提高工作效率。研究結(jié)果表明所建立的方法可有效擴(kuò)增各個(gè)Vβ亞家族編碼基因， 最少可從10個(gè)Jurkat細(xì)胞提取的RNA中擴(kuò)增成功。我們設(shè)計(jì)的PCR引物有很好的亞家族特異性， 但分家族特異性不高， 難以完全區(qū)分各分家族特異性， 因此即使用單一引物擴(kuò)增到的Vβ編碼基因在序列上仍有較大異質(zhì)性， 用PCR產(chǎn)物直接測序效果較差， 但通過克隆測序可以準(zhǔn)確分析優(yōu)勢表達(dá)基因的序列。在分析的Vβ14亞家族基因的PCR產(chǎn)物克隆基因中， 15個(gè)克隆序列與Vβ14亞家族基因的同源性均大于75%， 序列差異主要在CDR3高變區(qū)。我們下一步將建立高效敏感的擴(kuò)增TCR Vα方法， 并通過綜合分析抗原特異性CTL TCR的α鏈和β鏈的表達(dá)譜特點(diǎn)， 深入了解疾病狀態(tài)下的細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制。

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該同學(xué)的實(shí)習(xí)職位是 _____________。

該學(xué)生在實(shí)習(xí)期間工作認(rèn)真，腳踏實(shí)地，虛心請教并且努力掌握工作技能，善于思考,能夠舉一反三。善解人意，積極配合領(lǐng)導(dǎo)及同事的工作，虛心聽取他人意見。在時(shí)間緊迫的情況下，能夠加時(shí)加班完成任務(wù)。能夠?qū)⒃趯W(xué)校所學(xué)的知識靈活應(yīng)用到具體的工作中去，保質(zhì)保量完成工作任務(wù)。同時(shí)，本公司將要求該學(xué)生嚴(yán)格遵守我公司的各項(xiàng)規(guī)章制度，實(shí)習(xí)時(shí)間，服從實(shí)習(xí)安排，完成實(shí)習(xí)任務(wù)，尊敬實(shí)習(xí)單位人員，并能與公司同事和睦相處。與其一同合作的員工都對該學(xué)生的表現(xiàn)予以肯定。

特此證明。